MAKALAH KROMATOGRAFI

MAKALAH

FITOKIMIA

(KROMATOGRAFI)

 

OLEH :

AINUN SAFITRI HARLI

70100112045

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI ALAUDDIN MAKASSAR

SAMATA-GOWA

2014

BAB I

PENDAHULUAN

A.  Latar  belakang

Kromatografi merupakan suatu metode pemisahan yang dewasa ini telah banyak digunakan, dibandingkan dengan metode yang lainnya seperti detilasi, kristalisasi, pengendapan, ekstraksi, dan lain-lain mempunyai keuntungan dalam pelaksanaan yang lebih sederhana, penggunaan waktu yang sangat singkat terutama mempunyai kepekaan yang tinggi serta mempunyai kemampuan memisahkan yang tinggi, Metode ini digunakan, jika dengan metode lain tidak dapat di lakukan misalnya karena jumlah cuplikan sangat sedikit atau campurannya kompleks.

Meskipun dasar kromatografi adalah suatu proses pemisahan namun banyak diantara cara ini dapat digunakan untuk analisi kuatitatif. Jenis-jenis kromatografi yang bermanfaat dalam analisi kualitatif dan analisis kuantitatif adalah kromatografi kertas, kromatigrafi lapis tipis (KLT), kromatografi kolom, kromatografi gas, dan kromatografi cair kinerja tinggi. Kromatografi kertas dan KLT pada umunya lebih bermanfaat untuk tujuan indentifikasi, karena lebih mudah dan sederhana.

Kromatografi kolom memberikan pemilihan fase diam yang lebih luas dan berguna untuk pemisahan campuran secara kuantitatif. Dalam indutri metode inibanyak dipakaiuntuk menghilangkan zat-zat yang tidak diinginkandalam hasil, misalnya pada pemurnian minyak tanah atau minyak goring dan pemurnian hidroksidayang dihasilkan dari proses elektrolisis.

Teknik pemisahan kromatografi dilakukan untuk mendapatkan pemisahan campuran diantara dua fase.Fase tersebut adalah fase diam dan fase gerak.Fase diam dapat berupa zat cair dan zat padat, sedangkan fase gerak dapat berupa zat cair atau gas.

Latar belakang dari makalah ini adalah menghadirkan materi dasar yang akan memperkenalkan dengan berbagai aspek dari proses kromatografi, menjelaskan dalam istilah yang sederhana bagaimana prinsip kerja kromato grafi, dan menunjukan beberapa penerapan yang telah membuat kromatografi tidak dapat diabaikan dalam berbagai bidang kehidupan.

B.  Rumusan masalah

1.      Apa pengertian dari kromatografi?

2.      Bagaimana pembagian kromatografi?

3.      Bagaimana cara membedakan fase gerak dan fase diam?

C.  Tujuan

1.      Mengetahui dan memahami pengertian kromatografi.

2.      Mengetahui dan memahami pembagian kromatografi.

3.      Mengetahui dan memahami cara membedakan fase gerak dan fase diam.

BAB II

PEMBAHASAN

A.  Pengertian Kromatografi

Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli botani RusiaMichael Tsweet pada tahun 1903 untuk memisahkan pigmen berwarna dalam tanaman dengan cara perkolasi esktrak petroleum eter dalam kolom gelas yangberisi kalsium karbonat (CaCo3). Saat ini kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umum dan paling sering digunakan dalam bidang kimia analisis dan dapat dimanfaatkan untuk melakukan analisis, baik analisis kualitatif, kuantitatif, atau preparative dalam bidang farmasi, lingkungan, industri, dan sebagainya. Kromatografi suatu teknik pemisahan yang menggunakan fase diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile phase)(Rohman, 2007).

Kromatografi adalah salah satu metode pemisahan kimia yang didasarkan pada adanya perbedaan partisi zat pada fasa diam (stationary phase) dan fasa gerak (mobile phase).Kromatografi berasal dari bahasa Yunani yaitu χρῶμα yang berarti warna dan γράφειν yang berarti menulis.

Kromatografi dapat bersifat preparatif maupun analitik.Tujuan kromatografi preparatif biasanya adalah untuk memisahkan senyawa dalam campuran (biasanya digunakan untuk pemurnian).Kromatografi analitik digunakan untuk mengetahui perbandingan senyawa dalam campuran.

Dalam kromatografi, dikenal beberapa istilah, antara lain:

1.    Analit adalah zat yang dipisahkan.

2.    Kromatogram adalah output visual yang diperoleh dari hasil pemisahan. Adanya puncak karakterisitik yang berbeda menunjukkan adanya senyawa yang berbeda.

3.    Eluen adalah pelarut yang digunakan untuk memisahkan analit.

4.    Fasa gerak adalah fasa zat yang bergerak pada arah tertentu.

5.    Fasa diam adalah fasa yang tetap pada tempatnya.

6.    Waktu retensi adalah waktu yang diperlukan analit untuk melewati sistem.

7.    Volume retensi adalah volume fasa gerak yang dibutuhkan untuk mengelusi komponen analit.

B.  Pembagian/penggolongan kromatografi

Penggolongan kromatografi ada 3 yaitu :

1.      Berdasarkan prinsip/mekanisme pemisahan

2.      Berdasarkan fase yang digunakan

3.      Berdasarkan alat yang digunakan

1.      Kromatografi Berdasarkan prinsip/mekanisme pemisahannya pemisahannya, kromatografi dapat dibedakan menjadi: (a) kromatografi adsorpsi; (b) kromatografi partisi; (c) kromatografi penukar ion; (d) kromatografi eksklusi ukuran; (e) kromatografi afinitas.

a.       Kromatografi Adsorpsi

Adsorpsi merupakan penyerapan pada permukaannya saja dan jangan sekali-kali dikacaukan dengan proses absorpsi yang berarti penyerapan keseluruhan. Adsorpsi pada permukaan melibatkan interaksi-interaksi elektrostatik seperti ikatan hidrogen, penarikan dipol-dipol, dan penarikan yang diinduksi oleh dipole.Silika gel merupakan jenis absorben (fase diam) yang penggunaannya paling luas.Permukaan silika gel terdiri atas gugus Si-O-Si dan gugus silanol (Si-OH). Kromatografi Adsorpsi seperti:

1)      Kromatografi Kertas

Pada kromatografi kertas sebagai penjerap digunakan sehelai kertas dengan susunan serabut dan tebal yang sesuai.Sebagai alternatif dapat juga digunakan sistem dua fase.Kertas diimpregnasi dengan salah satu fase yang kemudianmenjadi fase diam (umumnya fase yang lebih polar dalam hal kertas yang dimodifikasi).Kromatogram dilakukan dengan merambatkan fase gerak, melalui kertas. Dapat dilakukan kromatografi menaik, pelarut merambat naik pada kertas ditarik oleh gaya kapiler ataupun kromatografi menurun, pelarutnya mengalir oleh gaya gravitasi.

2)      Kromatografi Lapis Tipis

Pada KLT, zat penjerap merupakan lapis tipis serbuk halus yang dilapiskan pada lempeng kaca. Plastik atau logam secara merata, umumnya digunakan lempeng kaca. Pemisahan yang tercapai dapat didasarkan pada adsorpsi, partisi atau kombinasi dari kedua efek, tergantung jenis penyangga, cara pembuatan, dan jenis pelarut yang digunakan. Perkiraan identifikasi diperoleh dengan pengamatan bercak dengan harga Rf yang identik dan ukuran yang hamper sama. Dengan menotolkan zat uji dan baku pembanding pada lempeng yang sama. Bercak dapat dikerok dari lempeng, kemudian diekstraksi dengan pelarut yang sesuai dan diukur secara spektrofotometri.

Kromatografi kertas termasuk kromatografi partisi.Fasa diamnya air dan fasa penyokongnya adalah selulosa.Fasa geraknya biasanya merupakan campuran dari salah satu pelarut-pelarut organik atau air.Setelah elusi selesai, noda ditandai dengan penanda.Bila noda tidak berwarna maka harus dideteksi secara fisika dan kimia.

a.      Secara fisika dengan menggunakan uap iodium, lampu UV

b.      Secara kimia dengan menggunakan pereaksi cerium sulfat,

      dragendrof, liberman burchard.

Kecepatan elusi pada kromatografi kertas dipengaruhi oleh:

a.       Ketebalan kertas

b.      Kekentalan eluen

c.       Pelarut, jangan menggunakan pelarut yang terlalu cepat

      menguap.

   Pada kromatografi kertas, eluen bergerak berdasarkan gaya kapiler dari bawah keatas (ascending) sama dengan KLT. Tetapi bisa juga dengan gaya gravitasi bila elusinya dari atas ke bawah (descending). Eluen yang digunakan pada kromatografi kertas umumnya adalah campuran berbagai pelarut terutama air.

Kertas kromatografi yang sering digunakan adalah kertas whatmann yang beredar bermacam-macam seperti ukuran 20 x 20 cm, 5 x 100 cm dan 50 x 50 cm.

Kromatografi kertasserat fasa penyokongnya lebih pendek, bercaknya lebih kecil dari pada KLT (kromatografi lapis tipis), waktunya lebih lama dari pada adsorben lain, tapi lebih singkat dari pada KLTtidak bisa menggunakan pereaksi H2SO4 karena selulosa akan terdekomposisi.

b.       Kromatografi Partisi

Partisi merupakan analog dengan ekstraksi pelarut.Fase diam diikatkan pada padatan lapis tipis yang lembam (inert). Karena fase diam cair diikatkan pada padatan pendukung maka masih diperdebatkan apakah proses adsorpsinya merupakan partisi murni atau partisi yang dimodifikasi karena absorpsi juga mungkin terjadi (Rohman,2007).

Cara ini didasarkan pada partisi linarut antara dua pelarut yang tak bercampur, salah satunya diam (fase diam) dan yang lainnya bergerak (fase gerak). Pada tahap awal KC, fase diam dibuat dengan cara yang sama seperti membuat penyangga kromatografi gas (Johnson, Stevenson,1991).

c.       Pertukaran Ion

Cara ini didasarkan pada pertukaran (penjerapan) ion antara fase gerak dan titik ion pada kemasan.Banyak dammar diperoleh dari kopolimer stirena divinilbenzena yang telah ditambahi gugus fungsi.Dammar jenis asam sulfonat dan jenis amin kuartener merupakan pilihan terbaik untuk sebagian besar pemakaian.Baik fase terikat maupun dammar telah digunakan. Cara tersebut banyak dipakai dalam ilmu hayat, contohnya pemisahan asam amino, dan dapat pula dipakai untuk pemisahan kation dan anion (Jonhson, Stevenson,1991)

d.      Kromatografi Eksklusi

Eksklusi berbeda dari mekanisme sorpsi yang lain, yakni dalam eksklusi tidak ada interaksi spesifik antara solute dengan fase diam. Teknik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari zat padat pengepak (fase diam). Pengepak adalah suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat kecil (porous) yang inert.Sebagai fase gerak digunakan cairan. Kromatografi jenis ini sangat dipengaruhi oleh perbedaan bentuk struktur dan ukuran molekul (Rohman,2007).

e.       Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kromatografi cair kinerja tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dikembangkan pada akhir tahun 1960an dan awal tahun 1970an. Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairanfisiologis;menentukan kadarsenyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis,

2.      Kromatografi berdasarkan fase yang digunakan dapat dibedakan menjadi (a) kromatografi Padat cair; (b) kromatografi Padat cair;  (c) kromatografi Cair cair (k.partisi); (d) kromatografi Gas cair

a.       kromatografi Padat cair

bila fase geraknya berupa air sedangkan fase diamnya berupa padatan yang amorf yang dapat menyerap. 

b.      Kromatografi gas-padat, bila fase geraknya berupa gas dan fase diamnya berupa padatan yang dapat menyerap/mengadsorp. 

c.       Kromatografi cair-cair, bila fase gerak dan diamnya berupa cairan, dimana fase diamnya dilapisi pada permukaan padatan pendukung yang inert 

d.      Kromatografi gas-cair, bila fase geraknya berupa gas dan fase diamnya berupa cairan yang dilapiskanpada padatan pendukung yang inert.

3.      Kromatografi Berdasarkan alat yang digunakan dapat dibedakan menjadi

(a)    Kromatografi planar; (b) HPLC; (c) Kromatografi kertas; (d) Kromatografi cair kinerja tinggi; (e) kromatogarfi vakum; (f) kromatografi kolom.

a. Kromatografi kolom, apabila komponen yang akan dipisahkan bergerak bersama fase gerak melalui sebuah kolom kemudian setiap komponen terpisahkan berupa zona-zona pita. Pada kromatografi analitik setiap komponen yang keluar dari kolom akan dicatat oleh rekorder dan disajikan dalam bentuk puncak (peak) yang menunjukkan konsentrasi eluen sebagai fungsi waktu. Untuk suatu senyawa yang mengandung komponen tunggal akan ditandai dengan waktu elusi yang tampak pada konsentrasi eluen maksimum. Tinggi atau luasan puncak sebanding dengan konsentrasi komponen sampel. Pada kromatografi preparatif, akan diperoleh sejumlah fraksi isolate dari komponen sampel dalam fase gerak.

b. Kromatografi planar (kromatografi lapis tipis dan kromatogafi kertas), apabila komponen yang akan dipisahkan bergerak bersama fase gerak dalam sebuah bidang datar. Senyawa yang bergerak berupa bentuk noda (spot) yang dapat dikenali dengan bantuan metode fisika, kimia, maupun biologis. Posisi noda menunjukkan identitas suatu komponen / senyawa, sedangkan besar atau intensitasnya menunjukkan konsentrasinya. Pada kromatografi planar beberapa komponen dapat dipisahkan secara bersamaan maupun dipisahkan dengan dua langkah yang pertama, Cara ini dikenal dengan metode kromatografi dua dimensi.

c. Kromatografi cair kinerja tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dikembangkan pada akhir tahun 1960an dan awal tahun 1970an. Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairanfisiologis;menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis.

d. Kromatografi cair vakum (KCV)

Kromatografi Cair Vakum (KCV) merupakan salah satu metode fraksinasi yaitu dengan memisahkan crude extract menjadi fraksi-fraksinya yang lebih sederhana. Pemisahan tersebut memanfaatkan kolom yang berisi fasa diam dan aliran fasa geraknya dibantu dengan pompa vakum.Fasa diam yang digunakan dapat berupa silika gel atau alumunium oksida (Ghisalberti, 2008).

Fasa diam yang digunakan dikemas dalam kolom yang digunakan dalam KCV. Proses penyiapan fasa diam dalam kolom terbagi menjadi dua macam, yaitu:

a.        Cara Basah

Preparasi fasa diam dengan cara basah dilakukan dengan melarutkan fasa diam dalam fase gerak yang akan digunakan. Campuran kemudian dimasukkan ke dalam kolom dan dibuat merata.Fase gerak dibiarkan mengalir hingga terbentuk lapisan fase diam yang tetap dan rata, kemudian aliran dihentikan (Sarker et al., 2006).

b.        Cara kering

Preparasi fasa diam dengan cara kering dilakukan dengan cara memasukkan fase diam yang digunakan ke dalam kolom kromatografi. Fase diam tersebut selanjutnya dibasahi dengan pelarut yang akan digunakan (Sarker et al., 2006).

Preparasi sampel saat akan dielusi dengan KCV juga memiliki berbagai metode seperti preparasi fasa diam. Metode tersebut yaitu cara basah dan cara kering (Canell, 1998). Preparasi sampel cara basah dilakukan dengan melarutkan sampel dalam pelarut yang akan digunakan sebagai fasa gerak dalam KCV. Larutan dimasukkan dalam kolom kromatografi yang telah terisi fasa diam. Bagian atas dari sampel ditutupi kembali dengan fasa diam yang sama. Sedangkan cara kering dilakukan dengan mencampurkan sampel dengan sebagian kecil fase diam yang akan digunakan hingga terbentuk serbuk. Campuran tersebut diletakkan dalam kolom yang telah terisi dengan fasa diam dan ditutup kembali dengan fase diam yang sama (Canell, 1998; Sarker et al., 2006).

e.       HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Teknik pemisahan HPLC memiliki banyak keunggulan dibanding dengan kromatografi lainnya, diantaranya adalah: cepat dalam proses analisa, resolusi yang lebih tinggi, sensitivitas detektor yang lebih tinggi, kolom yang dipakai dapat digunakan kembali, ideal dan cocok untuk zat bermolekul besar dan berionik dan mudah untuk rekoveri sampel. HPLC boleh dibilang sebagai teknik tercanggih dalam metode kromatografi. HPLC juga menggunakan sistem instrumen seperti pada kromatogarfi gas. Di dalam teknik ini juga digunakan tekanan dan kecepatan yang cukup tinggi sehingga mampu dihasilkan resolusi yang lebih baik.

Jenis kromatografi yang bermanfaat dalam analisa kualitatif dan kuantitatif

yang digunakan dalam penetapan kadar dan pengujian Farmakope Indonesia adalah kromatografi Kolom, Kromatografi Gas, Kromatografi Kertas, Kromatografi Lapis Tipis dan KCKT.

C.  Cara membedakan fase gerak dan fase diam

1.   Fase diam (Stationary phase) merupakan salah satu komponen yang penting dalam proses pemisahan dengan kromatografi karena dengan adanya interaksi dengan fase diamlah terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen suatu senyawa analit termasuk asam amino. Fase diam dapat berupa bahan padat atau porous (berpori) dalam bentuk molekul kecil atau cairan yang umumnya dilapiskan pada padatan pendukung.

2.   Fase gerak (Mobile phase) merupakan pembawa analit (asam amino), dapat bersifat inert maupun berinteraksi dengan analit tersebut. Fase gerak dapat berupa bahan cair dan dapat juga berupa gas inert yang umumnya dapat dipakai sebagai carrier gas senyawa mudah menguap (volatil).

BAB III

PENUTUP

A.    Kesimpulan

Kromatografi merupakan suatu metode pemisahan yang dewasa ini telah banyak digunakan, dibandingkan dengan metode yang lainnya seperti detilasi, kristalisasi, pengendapan, ekstraksi, dan lain-lain mempunyai keuntungan dalam pelaksanaan yang lebih sederhana, penggunaan waktu yang sangat singkat terutama mempunyai kepekaan yang tinggi serta mempunyai kemampuan memisahkan yang tinggi, Metode ini digunakan, jika dengan metode lain tidak dapat di lakukan misalnya karena jumlah cuplikan sangat sedikit atau campurannya kompleks.

Penggolongan Kromatografi

¨  Berdasarkan prinsip/mekanisme pemisahan

¨  Berdasarkan fase yang digunakan

¨  Berdasarkan alat yang digunakan

Cara membedakan fase gerak dan fase diam

¨  Fase diam (Stationary phase) merupakan salah satu komponen yang penting dalam proses pemisahan dengan kromatografi karena dengan adanya interaksi dengan fase diamlah terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen suatu senyawa analit termasuk asam amino. Fase diam dapat berupa bahan padat atau porous (berpori) dalam bentuk molekul kecil atau cairan yang umumnya dilapiskan pada padatan pendukung.

¨  Fase gerak (Mobile phase) merupakan pembawa analit (asam amino), dapat bersifat inert maupun berinteraksi dengan analit tersebut. Fase gerak dapat berupa bahan cair dan dapat juga berupa gas inert yang umumnya dapat dipakai sebagai carrier gas senyawa mudah menguap (volatil).